一、科学解读

精准医学关注每位患者的个人特征，旨在给患者提供更准确的治疗和预防策略。研究表明，常规检测临床相关突变基因可用于疾病的早期筛查、诊断、评估治疗反应及监测复发。单核苷酸变异（SNV）是一种常见的基因突变形式，特定SNVs可能导致癌症发生与发展。通过检测SNVs，能够评估个体的癌症风险，实现早期筛查和个性化治疗。例如，BRCA1和BRCA2基因的某些SNVs与乳腺癌和卵巢癌密切相关，而TP53R249S SNV突变则是东南亚地区肝细胞癌的常见突变位点，能够作为早期检测的生物标志物。

目前广泛采用的SNVs检测技术包括下一代测序（NGS）、TaqMan-MGB qPCR和扩增阻滞性突变系统qPCR（ARMS-qPCR）。NGS被视为检测SNV的金标准，但其操作复杂且结果特异性存在争议（错误率为0.1%-15%）。TaqMan-MGB qPCR和ARMS-qPCR的原理相似都是依靠与靶基因不匹配的探针或引物来检测SNVs。两种方法的突变基  因和野生型基因都是通过计算ΔCt值或使用电泳来确定的，因此，这两种方法的准确性会受到一定影响（灵敏度≥1%）。

综上所述，上述技术都面临实际应用上的限制：如，样本中突变拷贝数低、灵敏度不足和成本较高等问题。目前，对于普遍适用且特异性高的SNV检测方法的需求仍未得到满足。

二、研究内容概述

针对上述问题，国科宁波生命与健康产业研究院分子病理与体外诊断团队朱鹏研究员带领团队成员设计了一种将扩增阻滞突变系统与数字液滴技术相结合的新方法，命名为突变选择扩增液滴数字PCR（Mutation-Selected Amplification droplet digital PCR，MSA-ddPCR），用于对临床样本中的特定基因的SNV进行高灵敏度的定量分析（图1A），同时其检测结果背景值较低，具备良好的特异性，有望成为检测临床热点突变的可靠工具。

在此项研究中，为了提高突变选择扩增液滴数字PCR（MSA-ddPCR）的准确性和扩增效率，科研人员根据实验条件调整了长引物和短引物的浓度比例。此外，为了增强长引物对DNA模板单碱基差异的分辨能力并减少非特异性信号，采取了以下措施：首先，优化了不配对碱基的位置和类型，选择了3'端倒数第二个碱基，并设计了A-G碱基错配（见图1B）；其次，将该方法与数字液滴生成技术结合，提升灵敏度的同时降低了反应体系中杂质的干扰。在扩增体系中，使用了带有MGB的探针，以提高荧光报告效率，从而增强MSA-ddPCR的准确性。

表1. 目前已报道的SNVs检测方法的LOD比较

采用优化后的方案，MSA-ddPCR能够准确检测TP53WT质粒DNA中低至0.01%的TP53R249S突变频率。与现有的SNVs检测方法相比，该方法在突变检测的最低检出限（LOD）表现令人满意（见表1）。在临床样本应用中，MSA-ddPCR对突变DNA的检测能力与下一代测序（NGS）方法相当，甚至优于扩增子高通量测序。这表明，MSA-ddPCR能够有效检测临床样本中较低的拷贝数。此外，与高通量测序（需7天，费用约100美元）相比，MSA-ddPCR仅需4小时，费用为30美元，显示出更快的速度和更低的成本。目前，大多数可用的突变检测方案都侧重于血浆样本。

图2 MSA-ddPCR用于血浆样本和FFPE组织样本的检测结果评估图

图2解读：（A）血浆样本和FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本中MSA-ddPCR和扩增子高通量测序的检测结果汇总。VAF：变异等位基因频率。（B）阴性-阳性结果汇总表。（C）35个样本中MSA-ddPCR和扩增子高通量测序检测结果的相关性分析。ICC=0.743，95%CI[0.548-0.862]。ICC：类内相关系数，95%CI：95%置信区间。（D）ROC曲线。以扩增子高通量测序为参照时，AUC为0.941。ROC曲线：受试者工作特征曲线，AUC：曲线下面积。（E）FFPE组织样本和血浆样本中的VAFs对比图。

科研人员开发的MSA-ddPCR不仅适用于血浆样本，还能够对固定性石蜡包埋（FFPE）组织中提取的低质量DNA进行特定基因的SNV检测（图2）。这一特性使得MSA-ddPCR能够在实际应用中对来自同一患者的不同类型样本进行交叉检测验证，从而进一步提升检测的可靠性和准确性。这种多样化的适用性扩展了MSA-ddPCR在临床诊断中的潜在应用，特别是在需要对复杂样本进行深入分析的情况下。整体来看，MSA-ddPCR在突变检测方面展现出了优越的性能，为精准医学的发展提供了有力的支持。

三、相关成果

Analytica Chimica Acta

该工作近期以题为“Mutation-Selected Amplification droplet digital PCR: A new single nucleotide variant detection assay for TP53R249S mutant in tumor and plasma samples”的论文发表在Analytica Chimica Acta上。

Anal. Chim. Acta, 2024, 342929；

DOI: 10.1016/j.aca.2024.342929

项目支持

本研究得到了以下项目的资助：

· 国家自然科学基金

   82072876

   82372332

   82373383

· 浙江省基础公益研究项目

   LGF22H190003

· 宁波临床消化系统肿瘤研究中心

   2019A21003