一、科学解读

随着水产品消费增加和水产养殖业的快速发展，弧菌引起的水产病害与食源性疾病问题日益严峻，而随着耐药菌株、超级细菌和药物残留等问题的出现，利用特异性噬菌体的方法具有明显的优势。然而在噬菌体应用中往往伴随着弧菌的抗噬菌体突变，目前对细菌抗噬菌体突变的了解较少，而对细菌获得抗噬菌体能力后可能引起的trade-off效应了解更好。本研究瞄准这一认识薄弱环节，以副溶血弧菌的抗噬菌体突变株为研究对象，重点研究基因突变赋予宿主抗噬菌体能力，及基因突变后宿主的其他变化。

图2 噬菌体的基因组特征

图2解读：(A) PGA的基因组特征；(B) PGB的基因组特征；(C) PGA的安全性和有效性；(D) PGA的安全性和有效性；(E) PGA的系统发育分析（圆形）；(F) PGA的系统发育分析（矩形）；(G) PGB的系统发育分析（圆形）；(H) PGB的系统发育分析（矩形）。

针对以上问题，国科宁波生命与健康产业研究院细菌微生态研究创新中心孙越超团队从近海沉积样品中分离出2个噬菌（PGA和PGB）与副溶血弧菌共培养后，副溶血弧菌为了抵抗噬菌体感染发生了基因突变。多组测序预测突变位点的基因与与flaG基因有关，flaG基因是一种鞭毛基因，具有趋化性和运动性，使噬菌体无法吸收到宿主的细胞表面。野生型与突变株的代谢能力虽无差异但野生型菌株的生长竞争力强于抗噬菌体突变株，抗噬菌体突变株以牺牲生长竞争力为代价获得了噬菌体抗性。研究结果有助于对细菌-噬菌体的相互作用有更加全面深入的认识和了解，为噬菌体疗法应用于细菌病害防治提供新思路。

二、研究内容概述

图3 PGA和PGB裂解效果

图3解读：(A) PGA的裂解效果；(B)PGB的裂解效果；(C) PGA和PGB的裂解效果。

从一个大型水产养殖区域的近海沉积物中分离纯化出两种可以针对副溶血性弧菌的噬菌体（PG1与PGB）并对噬菌体的生物学特性进行分析研究，见图1-3。在测定噬菌体对宿主细菌的生长抑制作用过程中发现副溶血弧菌发生自发性突变。基于噬菌体共培养实验，推测副溶血性弧菌的自发突变可能导致对噬菌体吸附的抑制。

图4 噬菌体吸附副溶血性弧菌的透射电镜观察。

图4解读：(A)PGA吸附野生型菌株；(B) PGA吸附抗噬菌体突变株；(C)PGB吸附野生型菌株；(D)PGB吸附抗噬菌体突变株。

为了证实这一假设，科研人员将副溶血性弧菌和混合噬菌体共培养17轮后分离出抗噬菌体突变株。然后用透射电镜观察了噬菌体的吸附过程。结果（图4）证实副溶血性弧菌的自发突变导致对噬菌体吸附的抑制。

为了确定与噬菌体吸附相关的基因组变化，科研人员对自发的抗噬菌体突变株（VP-17）和野生型菌株（MCCC 1A16298）进行了多组测序。差异表达分析结果显示与野生型菌株相比，抗噬菌体突变株中有316个基因表达上调，466个基因表达下调。前10个显著上调和下调的基因参与了分解代谢和对刺激的适应。

图5  从野生型菌株到抗噬菌体突变株的遗传变化

图5解读：(A)差异基因火山图谱；(B) KEGG功能富集分析图；(C) GO功能富集分析图；(D)突变位点基因与差异表达基因相互作用关系的网络图，蓝色为差异表达基因，黄色为带有突变位点的基因；(E) SNPs比较图。

总的来说，在共培养过程中，副溶血性弧菌的丙酮酸代谢、丙酸代谢、糖酵解/糖异生和鞭毛组装相关基因的表达差异更大。这些基因的功能与细菌的生存和对刺激的适应密切相关，氧化石墨烯富集分析也显示了类似的结果。对突变位点所在的基因与差异表达基因之间的相互作用分析表明，突变位点所在的基因1_orf 01980与90个差异基因存在相互作用关系（图5）。1_orf 01980预测与flaG基因有关，flaG基因是一种鞭毛基因，具有趋化性和运动（Ahmmed et al.，2019）。使用第一代测序对SNPs进行测序验证，结果如图5E所示，抗噬菌体突变株存在SNP突变位点。

图6 培养24 h后一组代表性Biolog GEN III微孔板图

图6解读：A-C，野生型菌株的三个独立的生物重复；D-F，抗噬菌体突变株的三个独立的生物学复制物

为了评估野生型菌株和抗噬菌体突变株的代谢能力，科研人员使用Biolog GEN III微孔板分析它们利用多种碳源的能力。肉眼观察Biolog GEN III微孔板，MCCC 1A16298和VP-17的碳源利用存在差异（图6A-F），表明这些井的碳源利用存在差异。统计分析通过t检验（图7A，B）显示，没有可见的增长在任何负面控制孔MCCC 1A16298和VP-17，并没有统计上显著差异的吸光度读数的积极的控制孔，并表明接种水平和生长速度在一个丰富的介质是相似的。在这三个时间点的生长曲线上，每个碳源的数据趋势相对一致（数据未显示）。因此使用24小时时间点对MCCC 1A16298和VP-17的比较增长率进行了详细的“终点”统计分析。

图7  野生型菌株和抗噬菌体突变菌株生长的比较分析

图7解读：(A)阴性对照孔的吸光度，每个实验孔在6、12、18和24 h收集的吸光度；(B)阳性对照孔的吸光度，每个实验孔在6、12、18和24 h收集的吸光度；C-J，每个面板分别对应于Biolog板中的一行。从24小时时间点的三个重复样本的原始数据吸光度值取平均值。x轴上提供每一行1-9井的碳源名称。每一组数据分别从左到右分别代表野生型菌株和抗噬菌体突变株；(K)野生型菌株和抗噬菌体突变株的生长竞争力，比较野生菌株和抗噬菌体突变株在不同时间点（60、260、610、610和1010 min）的比例。

特别令人惊讶的是，结果（图7 C-J）显示，VP-17和MCCC 1A16298之间没有统计学意义上的差异。然后检测野生菌株和抗噬菌体突变株的生长竞争力，将野生型菌株和抗噬菌体突变株按一定比例混合，并在不同时间点（60、260、610和1010 min）采集样品进行测序。结果（图7 K）显示，随着时间的推移，抗噬菌体突变株的比例下降，而野生型菌株的比例增加。换句话说，野生型菌株的生长竞争力强于抗噬菌体突变株。以上数据表明，该抗噬菌体突变株以牺牲生长竞争力为代价获得了噬菌体抗性。

三、相关成果

Frontiers in Microbiology

该工作近期以题为

“The trade-off of Vibrio parahaemolyticus between bacteriophage resistance and growth competitiveness”的论文发表在Frontiers in Microbiology上。

Frontiers in microbiology, 2024, 15 1346251.DOI:10.3389/fmicb. 2024.1346251.

项目支持

本研究得到了以下项目的资助：

· 国家自然科学基金项目

42006093

· 浙江省自然科学基金项目

ZCLTGY24H1901

· 宁波市自然科学基金项目

2021J323

2023J057

2021J324

2021J326

· 宁波市“北岸精英”人才工程项目

2023RC003

· 浙江省与宁波市医药卫生优势学科共建项目

2016-S04

·宁波市第二批优秀卫生人才——优秀中青年卫生技术人员

2012008